人喉癌细胞Hep-2：

赛维健联合X射线的协同作用

喉鳞状细胞癌(LSCC)是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤之一，具有高度侵袭性。对于局部晚期喉癌患者，放疗是手术后治疗的重要手段。由于喉癌细胞对射线的抵抗性，往往导致放疗失败，引起肿瘤复发和转移。因此，寻找有效的放射增敏剂是多年来肿瘤领域的热点。

本期文章就让我们跟随医院肿瘤科王抒老师的研究看一看雷替曲塞（赛维健）协同X射线对喉癌细胞的抑制作用。

01

材料与方法

1

细胞与试剂

2

细胞分组

将Hep-2细胞随机分为对照组、雷替曲塞组(RTX组)、照射组(IR组)和雷替曲塞加照射组(RTX+IR组)。

3

细胞克隆集落形成实验

IR组、RTX+IR组分别给予0、2、4、6、8、10Gy的X线照射后，立即将细胞用胰蛋白酶消化，并以~个/皿接种到60mm2培养皿中。孵育14d后，将菌落用甲醇固定，结晶紫染色。使用显微镜计数染色的集落数(每个集落不少于50个细胞)。实验独立重复3次。

克隆形成率PE=(克隆数/接种细胞数)×%

细胞生存分数SF=(处理组PE/对照组PE)×%

用单击多靶模型拟合细胞存活曲线计算各组平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)及增敏比(SER)。

4

细胞凋亡检测

六孔板指数生长的Hep-2细胞分组处理同上，照射后的细胞继续培养24、48h，用胰酶消化并收集各组细胞(包括上清液中的细胞)，冷PBS清洗2遍，加μL缓冲液重悬，再加入AnnexinV和碘化丙啶(PI)溶液各5μL，混匀，室温避光孵育15min后加入μL缓冲液，用流式细胞仪(BDFACSCalibur)进行检测。实验独立重复3次。

5

细胞周期检测

Hep-2细胞分组处理同上，照射后的细胞继续培养24、48h，用胰酶消化，收集各下固定过夜，避光将细胞加入含有50μL/mL的RNase酶和50μL/mLPL染色液，室温避光孵育30min后，流式细胞仪检测细胞周期各时相所占比例。

02

实验结果

1

雷替曲塞对Hep-2细胞敏感且增敏X射线

1.1

用不同浓度雷替曲塞(0.1、0.25、0.5、1.0、2.0μg/mL)处理Hep-2细胞后，细胞活力被抑制，并呈剂量依赖性(P0.05);随着时间延长，细胞活力进一步下降(P0.05，图1)。

1.2

雷替曲塞(0.1μg/mL)联合X线(2、4、6、8、10Gy)照射后，细胞存活分数明显低于相应剂量的接受单纯照射的细胞存活分数(P0.05，图2);RTX+IR组存活曲线肩区较IR组变窄(图2)。

细胞克隆形成实验是公认的验证肿瘤细胞放射敏感性的“金标准”。本研究结果提示，雷替曲塞联合放疗能显著减少Hep-2细胞的克隆形成数目，在放疗之前使用雷替曲塞可提高Hep-2细胞株对放疗的敏感性。

2

RTX+IR细胞凋亡率更高

细胞凋亡处理24h后，对照组、RTX组、IR组、RTX+IR组细胞凋亡率逐渐升高(P0.05);处理48h后，对照组、RTX组、IR组、RTX+IR组细胞凋亡率逐渐升高(P0.05)。其中，RTX+IR组细胞凋亡率较对照组、IR组升高(P0.01，图3)。

3

细胞周期

处理24h后，对照组、RTX组、IR组、RTX+IR组的细胞周期差异有统计学意义(P0.05);处理48h后，对照组、RTX组、IR组、RTX+IR组的细胞周期差异有统计学意义(P0.05)。其中，RTX+IR组与对照组、IR组相比，G2/M期细胞比例明显增加(P0.)

总结

本研究通过体外实验证明，雷替曲塞协同X线对人喉鳞癌Hep-2细胞的抑制作用，其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡和增加G2/M期阻滞有关，为雷替曲塞联合放射治疗在临床喉癌治疗中的应用提供了实验依据。

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