背景

CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现使人们能够在基因组尺度上研究基因功能。研究人员绘制了数百种癌细胞系的基因功能依赖图谱，这些数据显示，正如预测那样，存在大量没有发生突变但仍是癌细胞生长和存活所需的基因。这些先前未研究的依赖性图谱可能是易于追踪的药物靶点。事实上，在这些屏障中识别的许多目标现已得到验证，表明数据是可靠的。这些努力使我们能够扩大对已知癌基因之外的新治疗靶点的探索。加上药物开发方法的进步，如PROTACs(蛋白水解靶向嵌合体)和分子胶，这些技术突破所谓可药物靶点的限制，依赖性图谱有可能揭示选择性杀伤癌细胞的新途径，这是既往未曾考虑或利用过的。

简介

年4月21日，Dana-Farber癌症研究所儿童肿瘤科和麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的KimberlyStegmaier教授及其团队在CancerDiscovery(IF:29.)杂志上发表名为Selectivemodulationofapan-essentialproteinasatherapeuticstrategyincancer的研究[1]。NXT1与Nxf1异源二聚，共同构成主要的mRNA核输出机制。我们描述了NXT1和NXT2之间一种以前未被认识到的合成致死性机制：只有在两者都没有的情况下，它们共同的基本结合伙伴Nxf1才会丢失。我们提出了一种潜在的治疗策略，用于肿瘤选择性消除一种蛋白质，如果直接靶向，预计会引起广泛的毒性。

主要结果

CRISPR筛选优先考虑快速致死的体内相关依赖性

我们使用BroadInstitute的癌症依赖性图谱(DepMap)数据集(包括儿童癌症依赖性图谱)，确定了个假定的遗传依赖性(MYCN扩增神经母细胞瘤的强异常值或选择性依赖)和17个泛必需基因作为阳性对照(图1A)。我们生成了一个sgRNA文库，其中包括CRISPR介导的基因敲除(CRISPR)和CRISPR介导的基因干扰(CRISPR)的sgRNA、内含子引导控制拷贝数相关毒性效应，以及非靶向性和基因间靶向阴性对照。在第7、14和21天，我们对4种神经母细胞瘤细胞系：SKNDZ、CHP-、SK-N-BE和KELLY进行了CRISPR和CRISPRi时程耗竭筛选。值得注意的是，我们在第21天的结果与在这些细胞系中在该时间点进行的原始DepMap筛选中观察到的衰竭相关(图1B)。

图1.CRISPR筛选优先考虑快速致死的体内相关依赖性

核输出因子NXT1在神经母细胞瘤中具有选择性和致死性的依赖

在这些筛选的交叉点上，我们确定了一个依赖性基因NXT1，该基因在CRISPR和CRISPRi时间过程筛选中均被评为强阳性，在两个细胞系的AnnexinV筛选中均被评为阴性，并在体内进行了验证(图2A)。由该基因编码的蛋白质NXT1是一种核输出因子，其典型功能是作为NXF1介导的mRNAs从细胞核输出到细胞质的辅助因子，在细胞质中它们可以被翻译成蛋白质。自我们生成基因列表以来，DepMap数据集已增加了一倍多，但与较小的数据集一样，与所有其他癌细胞系(n=)相比，神经母细胞瘤细胞系(n=19)显著更依赖于NXT1，这表明这是一种选择性效应(图2B)。我们通过三种以NXT1为靶标的CRISPR指南确认了目标基因组编辑，并证实与对照sgRNAs相比，这些sgRNAs在神经母细胞瘤细胞系中诱导了严重的活性缺陷，以及通过膜联蛋白V/PI染色和PARP切割测量的细胞死亡(图2C-D)。

图2.NXT1在神经母细胞瘤中是选择性和致死性的依赖

NXT1缺失会导致必需蛋白NXF1的缺失

NXT1与NXF1的NTF2L结构域结合，共同形成一种结合mRNA并介导核输出的异源二聚体(图3A)。基于质谱的定量多重蛋白质组学研究表明，在我们的诱导型脱克隆系统中，当NXT1降解时，NXF1蛋白水平也会迅速下降(图3B)。敲除CRISPR介导的NXT1后，NXF1水平也下降，这表明这种观察不是由于脱靶降解(图3C)。在DepMap数据集中，NXF1是一种常见的必需元素，而NXT1则呈偏斜分布，多条线依赖于NXF1，而非NXT1(图3D)。因此，我们感兴趣的是，在不依赖于NXT1的细胞中，NXF1是否保持稳定。实际上，我们鉴定了少数不依赖于NXT1的神经母细胞瘤细胞系，并确定在CRISPR敲除或诱导NXT1降解后，NXF1水平保持稳定(图3E-I)。因此，NXT1的缺失会导致必需蛋白NXF1以一种特定的方式被清除，这解释了所观察到的深刻而选择性的致死性。

图3.NXT1损失导致NXF1损失

儿童癌症低表达NXT2，且比成人癌症更依赖于NXT1

神经母细胞瘤中NXT1缺失的深远和精确的致死性表明其可能是一种很好的治疗手段，因此我们试图确定其他癌症是否也可能易受NXT1缺失的影响。值得注意的是，在人类肿瘤表达数据中，我们观察到髓母细胞瘤和横纹肌肉瘤这两种其他儿童癌症类型也有非常低的NXT2表达(图4C)。因此，在儿童癌细胞系中，这种平行关系是是保守的(图5A)，并且儿童癌细胞系比成人癌细胞系更可能依赖于NXT1(图5B)，这种差异是由多种谱系驱动的，包括神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、髓母细胞瘤以及横纹肌样瘤细胞系(图5C)。为了进一步验证这一发现，我们证实胚胎型和肺泡型横纹肌肉瘤均缺乏NXT2表达，并且依赖于NXT1(图5D和E)。

图4.低NXT2表达是神经母细胞瘤依赖NXT1的必要和充分条件

图5.其他儿童癌症类型的NXT2较低，并且依赖于NXT1

结论及展望

最后，这些数据表明，NXT1依赖性机制在其他低NXT2肿瘤类型中仍然存在，如果NXT1能有效靶向，这将对患有几种不同不可治愈癌症的儿童产生广泛的益处。虽然成人癌症没有表现出相同谱系的低NXT2表达富集，但存在低NXT2的成人癌细胞系，可能一部分成人癌症患者也会从这一靶点的治疗利用中获益。仍然存在的一个关键问题是，为什么儿童癌症倾向于低表达NXT2，而它在成人癌症和正常组织中更普遍地表达NXT2。一种可能的解释是，根据定义，儿童癌症是通过分化失败产生的，低表达NXT2可能在导致儿童癌症的发育过程的未分化细胞中更常见。相比之下，成人癌症通常是由于发达组织中突变的累积而产生的，其中高表达的NXT2可能更为常见。未来的研究将需要更好地理解NXT2表达的调控，以及潜在的肿瘤内表达异质性。本研究的发现也强化了以下观点，即成人肿瘤药物用于儿童患者并不总是药物开发的有效策略，正如依赖性NXT1在小儿肿瘤中更为常见。

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